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      光復(fù)新聞

      生化實(shí)驗(yàn)中微生物常見檢測方法

      發(fā)布日期:2022/07/11


      微生物的檢測,無論在理論研究還是在生產(chǎn)實(shí)踐中都具有重要的意義。微生物生長意味著原生質(zhì)含量的增加,所以測定的方法也都直接或間接的以次為根據(jù),而測定繁殖則都要建立在計(jì)數(shù)這一基礎(chǔ)上。微生物生長的衡量,可以從其重量,體積,密度,濃度,做指標(biāo)來進(jìn)行衡量。

       

      生長量測定法 

      1、體積測量法:又稱測菌絲濃度法。
      原理:通過測定一定體積培養(yǎng)液中所含菌絲的量來反映微生物的生長狀況。
      菌絲濃度測定法是大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長的一個(gè)重要監(jiān)測指標(biāo)。這種方法比較粗放,簡便,快速,但需要設(shè)定一致的處理?xiàng)l件,否則偏差很大,由于離心沉淀物中夾雜有一些固體營養(yǎng)物,結(jié)果會(huì)有一定偏差。


      2、稱干重法:
      原理:利用離心或過濾法測定。一般干重為濕重的10-20%。稱干重發(fā)法較為煩瑣,通常獲取的微生物產(chǎn)品為菌體時(shí),常采用這種方法,如活性干酵母(activity  dry  yeast, ADY),一些以微生物菌體為活性物質(zhì)的飼料和肥料。


      3、比濁法:
      原理:微生物的生長引起培養(yǎng)物混濁度的增高。通過紫外分光光度計(jì)測定一定波長下的吸光值,判斷微生物的生長狀況。該法主要用于發(fā)酵工業(yè)菌體生長監(jiān)測。


      4、菌絲長度測量法:
      方法:對于絲狀真菌和一些放線菌,可以在培養(yǎng)基上測定一定時(shí)間內(nèi)菌絲生長的長度。


      微生物計(jì)數(shù)法

      1、血球計(jì)數(shù)板法:
      這種方法簡便,直觀,快捷,但只適宜于單細(xì)胞狀態(tài)的微生物或絲狀微生物所產(chǎn)生的孢子進(jìn)行計(jì)數(shù),并且所得結(jié)果是包括死細(xì)胞在內(nèi)的總菌數(shù)。


      2、染色計(jì)數(shù)法:
      為了彌補(bǔ)一些微生物在油鏡下不易觀察計(jì)數(shù),而直接用血球計(jì)數(shù)板法又無法區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞的不足,人們發(fā)明了染色計(jì)數(shù)法。


      3、比例計(jì)數(shù)法:
      將已知顆粒(如霉菌孢子或紅細(xì)胞)濃度的液體與一待測細(xì)胞濃度的菌液按一定比例均勻混合,在顯微鏡視野中數(shù)出各自的數(shù)目,即可得未知菌液的細(xì)胞濃度。


      4、液體稀釋法:
      對未知菌樣做連續(xù)十倍系列稀釋,根據(jù)估計(jì)數(shù),從最 適宜的三個(gè)連續(xù)的10倍稀釋液中各取5毫升試樣,接種1毫升到3組共15只裝培養(yǎng)液的試管中,經(jīng)培養(yǎng)后記錄每個(gè)稀釋度出現(xiàn)生長的試管數(shù),然后查最 大或然數(shù)表MPN(most probably number)得出菌樣的含菌數(shù),根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)計(jì)算出活菌含量。該法常用于食品中微生物的檢測,例如飲用水和牛奶的微生物限 量檢查。


      5、平板菌落計(jì)數(shù)法:
      這是一種最 常用的活菌計(jì)數(shù)法。但方法比較麻煩,操作者需有熟練的技術(shù)。平板菌落計(jì)數(shù)法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數(shù),而且同時(shí)將菌液中的細(xì)菌進(jìn)行了一次分離培養(yǎng),獲得了單克隆。


      6、試劑紙法:
      在平板計(jì)數(shù)法的基礎(chǔ)上,發(fā)展了小型商品化產(chǎn)品以供快速計(jì)數(shù)用。試劑紙法計(jì)數(shù)快捷準(zhǔn)確,相比而言避免了平板計(jì)數(shù)法的人為操作誤差。


      7、膜過濾法:
      用特殊的濾膜過濾一定體積的含菌樣品,經(jīng)丫叮橙染色,在紫外顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光,活細(xì)胞會(huì)發(fā)橙色熒光,而死細(xì)胞則發(fā)綠色熒光。

       

      生理指標(biāo)法

      微生物的生長伴隨著一系列生理指標(biāo)發(fā)生變化,例如酸堿度,發(fā)酵液中的含氮量,含糖量,產(chǎn)氣量等,與生長量相平行的生理指標(biāo)很多,它們可作為生長測定的相對值。


      1、測定含氮量:
      大多數(shù)細(xì)菌的含氮量為干重的12.5%,酵母為7.5%,霉菌為6.0%。根據(jù)含氮量×6.25,即可測定粗蛋白的含量。含氮量的測定方法有很多,如用硫酸,過氯酸,碘酸,磷酸等消化法和Dumas測氮?dú)夥ā?/p>


      2、測定含碳量:
      將少量(干重0.2-2.0 mg)生物材料混入1毫升水或無機(jī)緩沖液中,用2毫升2%的K2Cr2O7溶液在100 0C下加熱30分鐘后冷卻。加水稀釋至5毫升,在580nm的波長下讀取吸光光度值,即可推算出生長量。需用試劑做空白對照,用標(biāo)準(zhǔn)樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

       

      3、還原糖測定法:
      還原糖通常是指單糖或寡糖,可以被微生物直接利用,通過還原糖的測定可間接反映微生物的生長狀況,常用于大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長的常規(guī)監(jiān)測。


      4、氨基氮的測定:
      方法是,離心發(fā)酵液,取上清液,加入甲基紅和鹽酸作指示劑,加入0.02N的NaOH調(diào)色至顏色剛剛褪去,加入底物18%的中性甲醛,反應(yīng)數(shù)刻,加入0.02N的使之變色,根據(jù)NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根據(jù)培養(yǎng)液中氨基氮的含量,可間接反映微生物的生長狀況。


      5、其他生理物質(zhì)的測定:
      P,DNA,RNA,ATP,NAM(乙酰胞壁酸)等含量以及產(chǎn)酸,產(chǎn)氣,產(chǎn)CO2(用標(biāo)記葡萄糖做基質(zhì)),耗氧,黏度,產(chǎn)熱等指標(biāo), 都可用于生長量的測定。也可以根據(jù)反應(yīng)前后的基質(zhì)濃度變化,最 終產(chǎn)氣量,微生物活性三方面的測定反映微生物的生長。

       

       

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